PERENNITE ET EVOLUTION DE LA DETECTION DES ANTICORPS ANTITHYROIDIENS D. AL JABI*, H. WEIZANI*, C. HAMBERGER*, A. EYQUEM** Mots-clés : Antithyroglobuline, anti TPO, antiperoxydase thyroïdienne, antimicrosomes. PÉRENNITÉ ET ÉVOLUTION DE LA DÉTECTION DES ANTICORPS ANTITHYROIDIENS Bien que la responsabilité de l’autoimmunisation antithyroldienne ait été démontrée il y a 40 ans par Deborah Doniach et Roitt en clinique et par Witebsky et Rose en expérimentation, notre interprétation du déclenchement de ce processus est encore imparfaite. Des anticorps de titres élevés antithyroglobuline (anti Tg) et antimicrosomes, ont été décelés avec les techniques mises au point après 1950, la peroxydase thyroïdienne, (thyroperoxydase ou TPO) s’est révélée récemment être l’auto antigène majeur qui s’est substitué aux microsomes. Il convenait de juxtaposer les résultats obtenus au cours du temps avec des techniques diverses, d’interpréter leurs discordances apparentes et de rapporter les résultats obtenus dans l’évaluation en radio immunologie des anti Tg et anti TPO, sur plus de 1300 prélèvements de patients suspectés de thyréopathies. Key words : Antithyroglobulin, antithyroperoxydase, thyroid autoimmune diseases. FOLLOW UP 0F THE DETECTION 0F THE ANTITHYROID ANTIBODIES AMONG THYROID DISEASES Though the proof of autoimmunity has been gîven forty years ago, the origin of the pathogenesis of these autoimmune diseases remain unknown. The antithyroglobulin and the antimicrosomes are still the markers detected during thirty years by passive hemagglutination and now by Elisa and radioimmunology. However the detection of the antimicrosomes is now replaced by the detection of the antithyroid peroxydase. A comparaison has been made in the successive detection of the markers of both system, especially in the results obtained on more than 1300 samplesfrom patients suspected of thyroid disease. INTRODUCTION Des auto anticorps antithyroïdiens avaient déjà été mis en évidence en déviation du complément, au début du siècle par Marinesco (1908) dans le sérum de 3 des 4 goitres toxiques examinés, dont l’un vis à vis d’un broyat de sa propre thyroïde. Papazolu, élève de Marinesco, aussi par déviation du complément, décelait des anticorps antithyroïdiens chez 26 des 34 cas de thyrotoxicose examinés (1). En 1925, Hektoen rapportait la mise en évidence d’une précipitine antithyroglobuline dans le sérum d’un goitre exophtalmique (2). Il fallut attendre que la réalité de l’immunopathologie de l’auto immunisation soit reconnue pour que des anticorps de titres élevés antithyroglobuline et antimicrosomes soient décelés avec les techniques mises au point après 1950, notamment en hémagglutination passive, et que l’importance de leurs titres au cours des thyroïdites chroniques soit affirmée (en 1957). RAPPEL SUR LA SYNTHÈSE ET LA RÉGULATION DE LA FONCTION THYROÏDIENNE Si rapidement la distinction a été établie entre les anticorps anti Tg et les anticorps antimicrosomes, les techniques d’étude ont présenté, pour ces derniers surtout, des différences de sensibilité; de plus, si pour les anti Tg, la spécificité concerne essentiellement un épitope majeur de la Tg, pour les antimicrosomes la spécificité concerne le constituant majeur des microsomes, représenté par la peroxydase thyroïdienne. D’autres constituants antigéniques interviennent mais leur valeur diagnostique est encore imprécise et ils n’ont donc pas été l’objet d’études extensives. Notre étude résume l’évolution des résultats des anti Tg et des antimicrosomes puis anti TPO. 1 - ANTITHYROGLOBULINE (ANTI Tg) Il est rapidement apparu que les anticorps observés au cours des thyréopathies étaient inaptes à fixer le complément; en revanche, la technique d’immunodiffusion en milieu gélifié, mise au point par J. Oudin en 1946 et adaptée par Ouchterlony, pouvait révéler ces anti Tg. Elle a donc été exploitée par l’un de nous, dans les premiers cas examinés avec Jacques Decourt en 1958. 1. Détection des anti Tg en immunodiffusion double Cette technique est susceptible de fournir des résultats positifs lorsque la concentration des anticorps dans le sérum est supérieure à 0,2 mg/ml. La réaction est réalisée dans un gel d’agarose coulé dans une boîte de Petri, en mettant l’échantillon de sérum dans un puits du gel d’agarose face à un puits contenant la solution de thyroglobuline humaine. Les boîtes étant déposées à +40C, les lignes de précipitation apparaissent en 1 à 6 jours sous forme d’une ou deux lignes de précipitation ou d’une zone le clarification. Ces précipitines anti Tg sont révélatrices d’une forte immunité anti Tg correspondant à un titre supérieur à 5000 en hémagglutination passive. Elles ont été observées au cours des thyréopathies étudiées par l’un de nous avec J. Decourt, chez: 90% des thyroidites de Hashimoto, 12% des myxoedèmes primaires, 2% des Basedow et des tumeurs de la thyroïde, 0,3% des goitres colloides. L’immunoélectrophorèse a montré que les anti Tg étaient localisés dans les IgG, plus rarement dans les IgM ou les IgA. L’électrosynérèse, mise au point par A. Bussard, a permis ultérieurement de déceler, avec une plus grande sensibilité et plus rapidement, ces précipitines anti Tg. 2. Détection des anti Tg en immunofluorescence La technique de R. Coons, mise au point pour la détection des anticorps antitissulaires, après le séjour de l’un de nous à Harvard Medical School en 1956, est réalisée sur des coupes de thyroïde humaine (ou de thyroïde de singe mais non de thyroïde d’autres mammifères) fixées au méthanol pour la détection des anti Tg. Ceux-ci donnent un aspect nuageux de la colloide si le titre de l’anti Tg est supérieur à 1280 en hémagglutination passive. En son absence il est possible de déceler les rares anticorps anti CA2. 3. Détection en hémagglutination passive a) La technique de Fulthorpe, Roitt, Doniach (J. Clin. Path. 1961) utilise des globules rouges de mouton, tannés et formolés, dont une partie est sensibilisée par la Tg. On compare en tubes les titres vis à vis, d’une part de globules sensibilisés, d’autre part vis à vis de globules tannés. La comparaison de chaque dilution est indispensable du fait de la persistance d’antigènes hétérospécifiques sur les globules rouges de mouton. b) Les globules rouges humains, tannés et sensibilisés avec une solution de thyroglobuline humaine, ont été utilisés à partir de 1958 au laboratoire d’immunopathologie (A. Eyquem et J. de Saint Martin). Pour chaque sérum à examiner, deux séries de dilution (de 5 à 390 625) en tubes ou sur 12 cupules (de 1 ml) de plaques en plastique, sont réalisées et leur pouvoir agglutinant est comparé, d’une part pour les globules tannés et sensibilisés, d’autre part pour les globules tannés et non sensibilisés. La technique a été ultérieurement réalisée dans des plaques de plastique de Terasaki à cupules en V avec des dilutions de sérum de 5 à 390 625. c) Le traitement des globules rouges humains au glutaraldéhyde (de Saint Martin, Petit et Eyquem, 1974), a ultérieurement remplacé celui utilisant le formaldéhyde et fourni des globules traités qui se conservent pendant quelques semaines. d) Des globules rouges de dindons ont été aussi préférés en remplacement des globules de mouton, du fait de leur plus grande résistance (Welcome). Résultats de la détection des anti Tg en hémagglutination: les sujets normaux peuvent fournir une agglutination pour des dilutions de 160, des titres de 640 coïncident avec une discrète autoimmunisation, des titres atteignant 100 000 ou supérieurs indiquent une forte réaction autoimmunitaire les globules non sensibilisés ne sont qu’exceptionnellement agglutinés, le plus souvent par des sérums hyperglobulinémiques. 4. Détection par agglutination de particules de gélatine colorées et sensibilisées par la Tg (Fujirebio). Une réaction positive est représentée par la réunion des particules au fond des cupules après 3 heures de contact avec les dilutions des sérums à examiner. Les résultats positifs sont obtenus pour des dilutions comprises entre 1 600 et 25 600. De faibles titres sont observables chez 2 à 15% des sujets nor-maux. 5. Détection des anti Tg en Elisa Elle se fait sur des plaques de plastique enduites de thyroglobuline humaine et la révélation avec une antiglobuline marquée à la peroxydase ou une autre enzyme, donnant une lecture automatisable. La trousse TGAb Elisa de Sanofi Diagnostics Pas-teur détecte des réactions positives pour des valeurs de 100 UI/ml; mais ces valeurs sont observées chez un fort pourcentage de sujets normaux; il semble que le seuil de 200 UI/ml soit plus spécifique. 6. Détection des anti Tg en radio immunologie La trousse TgAB IRMA Pasteur utilise une tech-nique de phase solide avec des tubes dont la paroi est enduite de thyroglobuline humaine. Les standards sont calibrés par rapport à la préparation internationale de référence MRC 65/93. II - DÉTECTION DES ANTIMICROSOMES La détection et le titrage des anticorps antimicrosomes ont été réalisés successivement par fixation du complément, immunofluorescence sur coupes de thyroïde d’homme ou de primates, agglutination passive de globules rouges ou de particules de gélatine et ulté-rieurement Elisa. L’antigène spécifique des microsomes est localisé sur les microvillosités des cellules thyroïdiennes face à la colloide. 1. Détection des antimicrosomes en fixation du complément Les microsomes sont obtenus à partir d’un fragment broyé de thyroïde humaine fractionné, ultracentrifugé, réparti et cryo desséché en ampoules 2. Détection des antimicrosomes en immunofluorescence Elle se fait sur les dilutions de sérum au 1/5 sur des coupes de thyroïde humaine (ou de singe) fixées par ventilation ou un fixateur ne dégradant pas la bordure thyroïdienne. Les titres des antimicrosomes semblaient relativement faibles en fixation du complément, du fait de la faible sensibilité de la technique utilisée alors, ainsi qu’en immunofluorescence qui était destinée au dépistage à la dilution du sérum à 1/5. 3. Détection des antimicrosomes en hémagglutination passive Elle peut être effectuée en plaques de Terasaki avec des globules sensibilisés avec une fraction microsomiale spécialement préparée. La réaction est plus sensible que la fixation du complément ou que 1’ immunofluorescence. 4. Détection des antimicrosomes par agglutination de particules en gélatine colorées et sensibilisées La réaction est effectuée sur des dilutions de sérums en plaque de Terasaki; les réactions positives sont indiquées par le rassemblement des particules au fond de la cupule pour des dilutions comprises entre 600 et 25 600. Des titres faibles sont observés chez 2 à 12% des sujets normaux. 5. Détection des antimicrosomes en Elisa Les microplaques de plastique sont enduites d’une suspension de microsomes de thyroïde humaine. La fixation des anticorps contenus dans les sérums à exa-miner est décelée par une antiglobuline marquée à la peroxydase. (Elias, Inova, Doxo). III - DÉTECTION SIMULTANÉE EN HÉMAG-GLUTINATION PASSIVE DES ANTI Tg ET DES ANTIMICROSOMES. En 1977, une étude de l’un de nous a montré, par hémagglutination passive, que sur 1 078 cas de thyréopathies: les antimicrosomes étaient décelés simultanément avec les anti Tg dans 7% des cas, les antimicrosomes étaient décelés isolément dans 14% des cas, les anti Tg étaient seuls décelés dans 5% des cas. L’étude en hémagglutination passive de Guillausseau, Eyquem et Savoie (3), sur 629 cas d’affections thyroïdiennes suivis par la même équipe en endocrinologie, a montré que les titres des antimicrosomes sont en réalité très élevés; ils sont mis en évidence dans 93% des 111 cas de thyroidite de Hashimoto examinés, dont 68% à un titre supérieur à 25 600. Dans cette même série, les antiTg étaient décelés dans 55% des cas de thyroidite de Hashimoto (Tableau 1). Sur la série de plus de 500 cas d’affections thyroïdiennes étudiés dans les mêmes conditions, la détection des antimicrosomes a été plus fréquente que celle des anti Tg dans toutes les affections, sauf pour la thyroïdite de de Quervain et les carcinomes thyroïdiens. Au total, les antimicrosomes avaient été décelés dans 235 cas, dont 104 associés à un anti Tg et 131 cas isolément. Les anti Tg étaient décelés isolément dans 47 cas. Parmi ces 629 cas, seuls 346 étaient dépourvus d’anti-thyroïdiens (anti Tg et antimicrosomes) à titre significatif. IV - DÉTECTION DES ANTI TPO La peroxydase thyroïdienne (ou thyroperoxydase ou TPO) représente le principal antigène des microsomes thyroïdiens. (4). Les anti TPO sont, pour 85% d’entre eux, spécifiques de 1'antigène immunodominant n°9 repéré par un des 13 anticorps monoclonaux; les autres anti TPO qui correspondent à des épitopes différents n’ont pas d’importance clinique reconnue. Les anti TPO sont aptes à fixer le complément; ils peuvent dans certains cas inhiber l’enzyme correspondante et avoir une action cytotoxique. 1. Détection des anti TPO en Elisa Différentes trousses sont disponibles utilisant des microplaques à cupules enduites de TPO obtenue: soit par purification : Boehringer, Radim, Biocode, soit par chimioluminescence : DPC Immulite, soit par recombinaison et expression dans Escherichia coli (Elias, Genbio), Une étude comparative de ces trousses et d’autres trousses à microplaques enduites de microsomes (Elias, Inova, Doxa) a été effectuée par Schmit, Gilson et Humbel (5). Cette étude a confirmé la plus grande sensibilité de la détection en Elisa des anticorps par TPO purifiée sur les antimicrosomes. Cependant, l’attention est attirée sur la défaillance de certaines trousses préparées avec de la TPO recombinée, présentant une antigénicité insuffisante. 2. Détection des anti TPO en radio immunologie Les anti TPO sont maintenant décelables par radio immunologie vis à vis de la thyroperoxydase. La détection et le titrage sont effectués à l’aide de tubes enduits par un anticorps monoclonal antithyroperoxydase qui fixe la thyroperoxydase marquée à 125I; cette fixation est inhibée par l’anticorps antithyroperoxydase s’il est présent dans le sérum à examiner. La sensibilité de la détection est supérieure à celle fournie par l’hémagglutination passive avec des valeurs comprises entre 100 et 10000 unités/ml pour 99% des maladies de Hashimoto. La réaction est aussi positive dans environ 50% des Myxoedèmes, des Basedow, ainsi que dans les thyroidites du post-partum, les hypothyroidies silencieuses et certains cancers différenciés. La négativité de la détection en radio immunologie permet d’infirmer la valeur de faibles titres déterminés en hémagglutination (Izembart et col. 1997). V - DÉTECTION COMPARÉE DES ANTI Tg ET ANTI TPO EN ELISA, IMMUNOFLUORESCENCE ET HÉMAGGLUTINATION PASSIVE L’étude de Catolano et Dubel (6) a porté sur les trousses Elisa TPOAb et TGAb de Sanofi Diagnostics Pasteur. Cette étude a montré que la sensibilité de l’Elisa anti TPO est légèrement supérieure à celle de l’immunofluorescence pour les antimicrosomes au cours des Hashimoto et des Basedow mais que la spécificité de l’immunofluorescence est plus élevée. La concordance globale est de 90%. Les spécificités des anti Tg par Elisa et hémagglutination passive sont excellentes puisque respectivement de 97 et 99%. En revanche, 10 des 15 sérums positifs en Elisa et négatifs en hémagglutination proviennent de Hashimoto ou de Basedow. VI- DÉTECTION SIMULTANÉE DES ANTI Tg ET ANTI TPO EN RADIO IMMUNOLOGIE Elle a été réalisée au CBMS (Institut Pasteur). Nous résumons ici les résultats obtenus de mai à décembre 1997 sur les prélèvements de 1 316 sujets suspects de thyréopathies, dont I 047 sont du sexe féminin (80%) et 269 du sexe masculin (20%) Les anti TPO ont été quantifiés en utilisant le DYNO Test anti TPO Brahms qui fournit des valeurs: normales, inférieures à 70 U/ml, douteuses, comprises entre 70 et 130 U/ml, positives, supérieures à 130 U/ml. Les anti Tg ont été recherchés à l’aide de la trousse TgAB IRMA Pasteur qui utilise une technique en phase solide sur des tubes dont les parois sont enduites de thyroglobuline. Les standards sont calibrés sur la préparation internationale de référence MRC 65/93 les valeurs normales sont inférieures à 50 UI/ml, les valeurs douteuses sont comprises entre 50 et 150 UI/ml, les valeurs positives sont supérieures à 150 UI/ml. RÉSULTATS Ils ont été regroupés, sans tenir compte du sexe: a) 57% (n = 749) fournissent des résultats négatifs pour les 2 systèmes, b) 12,5% (n = 165), fournissent des résultats positifs pour les 2 systèmes, c) 18,5% (n = 244) présentent des anti TPO et n’ont pas d’anti Tg, d) 2,1% (n = 28) présentent des anti Tg et n’ont pas d’anti TPO, e) les résultas douteux ont concerné 3,3% (n = 43) d’anti TPO et 7,3% (n = 9 6) d’anti Tg, pour lesquels nous n’avons pas recherché la dissociation ou l’homogénéité des réponses. Cette étude montre donc que la fréquence des anti TPO (31%) est plus élevée que celle des anti Tg (14,6%), la fréquence des anti TPO isolés(/g%), la rareté des anti Tg isolés. (2%). Ces observations sont en accord avec celles obtenues dans les recherches simultanées des anti Tg et antimicrosomes par hémagglutination passive avec les systèmes performants. CONCLUSION L’importance de l’immunité humorale contre la thyroglobuline qui s’était révélée dans les explorations immunologiques des thyréopathies a été confirmée avec l’apparition des différentes techniques d’agglutination passive ou automatisables d’Elisa et radio immunologie. Ces dernières techniques ont révélé que la fréquence des antimicrosomes est supérieure à celle des anti Tg. Cette observation a été confirmée par la détection des anti TPO, qui doivent donc être recherchées en priorité. La détection des anti Tg mérite néanmoins d’être demandée car 2% des dysthyroïdies présentent des anti Tg non associés à des anti TPO. Enfin, la qualité des détections des anti TPO dépend de l’origine de la TPO utilisée pour le réactif détecteur ce qui peut expliquer certaines discordances. BIBLIOGRAPHIE 1. PAPAZOLU. Soc. Biologie. 1911; 71: 671. 2. HEKTOEN. Proc. Nat. Acad. Sci. 1925; Il : 481. 3. GUILLAUSSEAU, EYQUEM, SAVOIE. Path. et Blo. 1985 33: 4. CZARNOCKA B. et col. CR. Acad Sc. 1985 300, série III z 577 5. SCHMIT, GILSON ET HUMBEL. lmm.. Biol. 1997 ; 12 : 348-352. 6. CATOLANO, DUBEL et col. An. Biol. Clin. 1997; 56 : 614-618. 7. ROITT t., DONIACH D. Lancet. 1958 ; 8:1027. 8. EYQUEM A., CALMETTE C., DECOURT J. Rev. Fse Et. Clu Bu. 1959 ; 4 : 823. 9. de SAINT MARTIN J., PETIT, EYQUEM A. 1974. *Centre de Biologie Médicale Spécialisée (CBMS), Institut Pasteur, 75724 PARIS cedex, France. **Professeur honoraire de l’institut Pasteur, 75724 PARIS cedex 15. France. Journées Internationales de biologie (JIB 97), 14 novembre 1997. L’Eurobiologiste 1998, Tome XXXII, N0 23517 - 189