LES MARQUEURS BIOLOGIQUES DU REMODELAGE OSSEUX D. ARDELEAN*, H. WEIZANI*, A. EYQUEM** Mots-clés : Ostéoporose, ostéoformation, résorption osseuse, ostéocalcine, pyridinoline, télopeptides du collagène. LES MARQUEURS DU REMODELAGE OSSEUX L'ostéoporose est caractérisée par une perte osseuse due à un déséquilibre entre l'ostéoformation et l'ostéorésorption. Ces anomalies du remodelage osseux peuvent être quantifiées par la mesure de marqueurs biologiques qui sont un reflet global à l'échelle du squelette. Il s'agit, soit de la mesure d'une activité enzymatique spécifique des ostéoblastes ou ostéoclastes, soit de la mesure de la matrice osseuse relarguée dans la circulation lors de la formation ou de la résorption osseuse. Les marqueurs de formation sont essentiellement la phosphatase alcaline osseuse, l'ostéocalcine et les peptides d'extension du procollagène . Pour les marqueurs de résorption, à côté des marqueurs classiques peu spécifiques que sont la calciurie, l'hydroxy prolinurie et la phosphatase acide tartrate résistante (TRAP), ce sont les agents de pontage du collagène (pyridinoline et désoxypyridinoline) qui apparaissent comme les plus performants. L'utilisation de ces marqueurs permet d'avoir une vue dynamique du métabolisme osseux et de disposer ainsi d'informations plus sensibles sur le risque fracturaire, laprédictivité de la perte osseuse et le suivi d'un traitement. Key words : Osteoporosis, bone formation, resorption, pyridinoline, osteocalcin, type I collagen telopeptide. BONE TURN OVER MARKERS Osteoporosis is a bone loss due to a lack of balance between bone formation and bone resorption. These bone turn over anomalies may be quantified by the measurement of biologic markers which are a global reflect of the bone state. It is the measurement of specific enzymatic activity of the osteoblasts or osteoclasts, or the measurement of the bone matrix products released in the circulation during bone formation or resorption. Bone formation markers are bone alkaline phosphatase, osteocalcin and procollagen type I extension peptides. Beside classic and run specific markers such as urinary calcium, urinary hydroxiproline and tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP), the collagen crosslinks agents (pyridinoline and deoxypyridioline) appears to be the more per formant markers for the bone resorption. Those markers give a dynamic view of the bone metabolism. They permit to get more informations on the fracture risk, the prediction of bone loss and the follow up of the treatment. Le remodelage osseux s'effectue selon un cycle de résorption-formation au sein d'unités fonctionnelles de remodelage, les BMU (Bone Modeling Units). L'activité globale résultant de ces processus peut être reflétée par la mesure d'une activité enzymatique ou par la mesure des produits de formation ou de dégradation de l'os. Dans 1'ostéoporose, un déséquilibre du remaniement osseux est très souvent présent. Ainsi, une diminution de l'activité ostéoblastique apparaît comme étant la principale caractéristique de l'ostéoporose de cause stéroidienne, tandis qu'une accélération de la résorption osseuse semble être un des événements primaires de la perte osseuse post ménopausique. Mais ces perturbations du remodelage osseux sont modérées et les modifications des paramètres classiques du métabolisme phosphocalcique sont trop faibles pour être utiles en pratique courante. La distinction entre les deux types de mécanisme nécessite encore des méthodes invasives ou coûteuses, telle que la biopsie de la crête iliaque, qui n'apportent que des renseignements sur le site de ponction mais ne donnent pas un reflet global du remodelage osseux, ou l'ostéodensitométrie biphotonique qui permet d'évaluer la perte osseuse (soit pour le corps entier, soit pour des régions osseuses déterminées). Compte tenu de la faible sensibilité de cette dernière technique, la variation ne devient détectable que pour une perte supérieure à 4% de la masse osseuse, correspondant à plus d'un an d'évolution sans traitement. Les récents progrès dans le domaine des marqueurs biochimiques du métabolisme osseux ont permis, en association avec l'évaluation densitométrique de la masse osseuse, de mieux caractériser les pathologies du remodelage osseux. En raison du couplage entre la formation et la résorption osseuse, le fait de traiter les marqueurs de formation et de résorption séparément est purement didactique. En pratique courante, en fonction de la pathologie recherchée, on utilise simultanément le dosage d'un marqueur de résorption et d'un marqueur de formation. MARQUEURS DE L'OSTÉOFORMATION La formation osseuse peut être évaluée par le dosage des molécules suivantes les phosphatases alcalines totales, ou mieux, les iso formes spécifiques osseuses, l'ostéocalcine (ou GLA protéine ou BGP Bone GI..A Protein), les peptides d'extension du collagène de type I. Les phosphatases alcalines sériques La mesure de la phosphatase alcaline dans le sérum est la plus communément utilisée comme marqueur d'ostéoformation. On distingue plusieurs groupes d'isoenzymes: placentaire, intestinale, osseuse, hépatique, rénale. Les phosphatases alcalines osseuses, hépatiques et rénales sont codées par le même gène et elles diffèrent entre elles principalement par le degré de glycosylation ou de sialilation responsable de leurs propriétés variées (stabilité chimique ou à la chaleur, comportement électrophorétique, etc.). L'activité sérique totale est constituée par l'addition des activités de trois isoformes qui ont la répartition suivante: hépatique 60-70% osseuse 30-40% intestinale < 5% L'isoenzyme osseuse est libérée dans la circulation sanguine lors de l'activation ostéoblastique. Elle a une demi vie de 1,6 jour et présente une clairance hépatique, donc son métabolisme peut être influencé par les affections hépatiques ou certains médicaments (1). Plusieurs méthodes de dosage ont été décrites, telles que l'inactivation par la chaleur, la précipitation par la lectine ou l'électrophorèse sur gel d'agarose, mais ces techniques manquent de sensibilité pour l'exploration des ostéoporoses. Un progrès réel a été apporté par l'utilisation d'anticorps monoclonaux reconnaissant l'isoenzyme osseuse; la réaction croisée avec la phosphatase alcaline hépatique est de 10-20%. Cette réaction croisée peut induire, en cas de pathologie hépatique, des valeurs faussement élevées. L'isoenzyme osseuse n'étant pas éliminée par le rein, son dosage peut être utilisé comme marqueur du remodelage osseux, même chez les patients souffrant d'une insuffisance rénale chronique. L'ostéocalcine L'ostéocalcine est une des plus abondantes protéines non collagéniques de l'os (les autres protéines non collagéniques présentes dans la matrice extracellulaire de l'os sont lostéonectine, l'ostéopontine, les sialoproteines osseuses). C'est un peptide monocaténaire de 49 AA, comportant trois résidus d'acide gamma carboxy glutamique (en position 17, 21,24) qui lui confèrent une forte affinité pour l'hydroxyapatite (11). Elle présente deux structures hélicoidales antiparallèles situées respectivement au niveau des AA 16-25 et 30-41, stabilisées par un pont disulfure entre les AA 23-29. Ces structures hélicoidales sont calcium dépen dantes. Les extrémités C et N terminales sont proches entre elles et pounaient partager des AA pour former un site antigénique. Sa synthèse est assurée exclusivement par les ostéoblastes au cours de la phase de minéralisation de l'ostéoide sous l'action du calcitriol et de la vitamine K. Le gène codant la synthèse d'une protéine prépro ostéocalcine est situé chez l'homme sur le chromosome 1. La préproostéocalcine est constituée d'un peptide signal de 23 AA, d'un propeptide de 26 AA et de l'ostéocalcine native 1-49. Le peptide signal est clivé dans le réticulum endo plasmique. La proostéocalcine subit ensuite une modification dépendante de la vitamine K qui conduit à la carboxylation des acides glutamiques GLU en GLA. Après clivage du propeptide, l'ostéocalcine native est enfin sécrétée dans le milieu extracellulaire où elle est incorporée dans la matrice osseuse. Une petite frac tion (15-30%) d'ostéocalcine nouvellement synthétisée est relarguée dans la circulation générale où elle peut être dosée. L'ostéocalcine n'étant pas relarguée lors de la résorption osseuse, sa concentration sanguine consti tuera un excellent marqueur de formation osseuse (6). Elle a une demi vie courte d'environ 5 minutes, en raison d'un métabolisme rénal et hépatique intense. Le rôle précis de l'ostéocalcine sur l'os est encore mal élucidé. Elle régulariserait la minéralisation de la matrice osseuse par fixation aux cristaux d'hydroxyapatite grâce à ses résidus glutamiques. Elle interviendrait dans le processus de la résorption osseuse par deux mécanismes chimiotactisme positif vis à vis des monocytes et macrophages du sang périphérique, différenciation des cellules préostéoclastiques en ostéoclastes et stimulation de l'activité de ces dernières. Au niveau sérique, à côté de l'ostéocalcine intacte 1-49, différents fragments (résultant de l'action des en zymes trypsiques) peuvent être retrouvés :1-19, 1-43, 20-43, 20-49, 44-49. Cette importante hétérogénéité des formes circulantes explique en partie les difficultés rencontrées lors de dosages de l'ostéocalcine. Il existe de nombreuses techniques de dosage de l'ostéocalcine dont les résultats divergent. Ces différences sont liées au manque de standardisation des dosages. Les premiers dosages développés reposaient sur le principe de compétition et étaient appelés hétérologues car ils utilisaient de l'ostéocalcine d'origine bovine purifiée comme standard et des Ac anti ostéocalcine bovine. Les dosages plus récents basés sur la méthode sandwich utilisent des réactifs d'origine humaine (dits homologues). Bien que les taux sériques d'ostéocalcine soient bien corrélés avec le niveau de formation osseuse, des discordances existent entre ces techniques. Ainsi, le taux sérique est fortement influencé par: - l'instabilité de la molécule intacte Lorsque des sérums ne sont pas congelés rapidement (dans l'heure qui suit le prélèvement), il se produit une dégradation de la molécule intacte avec accumulation du fragment 1-43. Avec des techniques de dosage de l'ostéocalcine intacte 1-49, une diminution importante des taux peut être observée si l'échantillon n'a pas été congelé dans l'heure qui suit le prélèvement. Si le délai entre le prélèvement et le dosage ne peut être respecté, l'utilisation d'une technique de dosage reconnaissant de manière égale l'ostéocalcine intacte et son fragment 1-43 serait plus appropriée. - la spécificité des anticorps utilisés Elle est liée à la nature des épitopes reconnus par l'anticorps. Il est important de déterminer si l'anticorps reconnaît l'ostéocalcine intacte seulement ou s'il reconnaît d'autres fragments (principalement le fragment N terminal). Chez les sujets normaux et les sujets ostéoporotiques, l'ostéocalcine intacte, le fragment N terminal 1-43 et les petits fragments représentent chacun respectivement environ un tiers du taux. En revanche, chez les sujets insuffisants rénaux, chez qui il existe une accumulation sérique du fragment 1-43, ce dernier représente plus de 50% de l'ostéoealcine totale (8). - la nature des anticorps utilisés Les premières techniques par compétition utilisaient des anticorps polyclonaux dirigés contre l'ostéocalcine bovine (du fait de la grande homologie entre les deux molécules d'ostéocalcine). Les dosages mis au point actuellement utilisent des anticorps monoclonaux dirigés contre l'ostéocalcine humaine. - certains anticorps sont calcium dépendants Il faut donc proscrire dans ces cas tout prélèvement sur EDTA. - la nature de l'étalon Les premiers dosages par compétition utilisaient l'ostéocalcine bovine comme standard et traceur. Les dosages les plus récents utilisent des standards humains. - la carboxylation de l'ostéocalcine La transformation des GLU en GLA dépend du statut vitaminique K du sujet. En cas de carence en vi tamine K, l'ostéocalcine sera sécrétée sous forme décarboxylée et, ne se fixant pas à la matrice osseuse, sera relarguée dans la circulation. Le résultat dépendra de la spécificité du dosage; si les formes carboxylée et décarboxylée de l'ostéocalcine sont reconnues de façon identique, une augmentation du taux pourrait être interprétée comme le reflet d'un haut remodelage osseux, alors qu'en réalité il existe un déficit de l'ostéocalcine carboxylée. Chez les sujets souffrant d'ostéoporose sénile, le taux de la forme décarboxylée est bien corrélé au risque fracturaire mais il n'existe pas de trousses commercialisées pour le dosage en routine. Les concentratjons élevées d'ostéocalcine sont trouvées habituellement dans les situations où la formation osseuse et la minéralisation sont augmentées. Une augmentation transitoire est observée pendant la préménopause chez la femme bien portante. Lors de l'ostéoporose post ménopausique, une grande dispersion des valeurs est observée du fait du polymorphisme de la maladie. Dans tous les cas, le taux d'ostéocalcine revient à des niveaux normaux à la suite d'un traitement hormonal substitutif. Dans l'ostéoporose sénile, on constate une augmentation de l'ostéocalcine décarboxylée circulante du fait d'une déficience probable en vitamines K et D. Ces taux élevés d'ostéocalcine décarboxylée sont corrélés à une densité osseuse basse et à un risque fracturaire élevé. Ainsi, l'ostéocalcine est un marqueur très utile de suivi thérapeutique chez les patients ostéoporotiques. Les propeptides du procollagène de type I Le collagène de type I est le plus abondant des constituants organiques de la matrice osseuse (90%). Il est synthétisé par les ostéoblastes et se compose de 3 chaînes polypeptidiques: 2 chaînes peptidiques ( 1), 1 chaîne différente mais homologue ( 2). Os et collagène de type I   Les différentes chaînes procollagéniques sont transportées dans le réticulum endoplasmique où elles sont transformées par des processus enzymatiques dont le principal est la transformation de la proline en hydroxyproline, sans laquelle le collagène ne peut apparaître sous la forme d'une triple hélice. Une autre transformation est l'hydroxylation de certains résidus lysine en hydroxylysine, indispensables à la formation de ponts entre différentes molécules de collagène. Lorsque la structure en triple hélice est obtenue, la molécule de procollagène est excrétée dans le liquide extracellulaire où elle est rapidement clivée aux extrémités N et C terminales par des enzymes spécifiques. Les propeptides d'extension sont relarguées dans la circulation sanguine dans un rapport stoechiométrique. Une portion du peptide N terminal est probablement réincorporée dans la matrice osseuse. Comme les molécules de collagène de type I et du peptide d'extension C terminal (P1CP) sont formées dans un rapport stoechiométrique, le dosage de P1CP permet d'évaluer la formation du collagène de type I. La concentration sérique de P1CP semble être déterminée génétiquement et l'interprétation du dosage par comparaison à une population de référence peut être source d'erreurs. La prise en compte des variations individuelles devrait permettre une meilleure utilisation de ce dosage. De plus, ces taux sont fortement influencés par la fonction hépatique (13). Des discordances existantes entre les différents mar queurs de formation peuvent être le reflet de l'expression de ces marqueurs à des stades différents de la maturation de l'ostéoblaste phase de prolifération : P1CP, phase de différenciation: PAL-PAO, phase de minéralisation : OC. MARQUEURS DE RÉSORPTION OSSEUSE La résorption osseuse peut être évaluée par des dosages (de molécules) non spécifiques la calciurie, l'hydroxyprolinurie, la phosphatase acide tartrate résistante, ou spécifiques les pyridinolines, les télopeptides du collagène de type I. La calciurie La calciurie à jeun corrigée en fonction de l'excrétion de la créatinine (indice de Nordin) reflète mieux le métabolisme osseux que le recueil de 24 heures qui prend en compte l'absorption intestinale. Ce marqueur est le reflet de l'aspect minéral de la résorption osseuse et aussi celui de la fonction rénale (l'insuffisance rénale entraînant une hypocalciurie). Le dosage réalisé par des méthodes colorimétriques est automatisable et peu cher. Il manque de sensibilité pour être utile à l'échelon individuel dans l'ostéoporose (3). La phosphatase acide plasmatique résistante à l'acide tartrique (TRAP) Les phosphatases acides sont des enzymes lysosomiales présentes dans l'os, la prostate, les plaquettes, les érythrocyles et la rate. L'isoenzyme sécrétée par les ostéoclastes présente la caractéristique d'être résistante à l'acide tartrique, contrairement à celle prostatique, ce qui est à la base du dosage enzymatique. L'utilisation de ce marqueur dans l'ostéoporose est limitée par son manque de spécificité, par son instabilité due à la présence d'inhibiteurs dans le sérum et par la difficulté de conserver les prélèvements même congelés. La mise au point d'une méthode immunométrique utilisant des anticorps spécifiques de l'isoenzyme ostéoclastique devrait aboutir dans l'avenir à un test plus performant (12). L'hydroxyproline urinaire Cet acide aminé est un composant majeur des collagènes (il représente environ 13% des acides aminés contenus dans les collagènes). Il est relargué lors de la résorption et n'est pas réutilisable pour la synthèse de nouvelles molécules de collagène (1). Le dosage urinaire, par une technique colorimétrique ou chromatographique, est effectué avant et après hydrolyse acide afin de doser l'hydroxyproline libre et totale. C'est un marqueur peu spécifique car son excrétion peut provenir de différentes sources: du collagène (osseux ou non osseux), des protéines non collagéniques (fraction Cl q du complément, élastine), des apports alimentaires (viandes, gélatine). Il est également peu sensible du fait que l'hydroxyproline ne représente qu'une faible proportion des molécules relarguées lors de la dégradation du collagène et du fait d'un important métabolisme hépatique. Son dosage tend à être abandonné au profit de marqueurs plus spécifiques. Les glycosides de l'hydroxylysine Il s'agit d'un autre acide aminé caractéristique du collagène excrété dans les urines après dégradation du collagène. Son dosage peut être réalisé par chromatographie liquide haute pression, actuellement réservée à la recherche. Les pyridinolines Les pyridinolines sont des molécules de pontage (crosslinks) qui stabilisent les chaînes de collagène au sein de la matrice extracellulaire. Elles existent sous deux formes qui se différencient par un groupement hydroxyl sur la chaîne latérale : la pyridinoline (PYR-Hydroxylysyle pyridinoline) abondante dans l'os et le cartilage, la déoxypyridinoline (DPYR-Lysyle pyridinoline) pré dominante dans le collagène osseux et la dentine, Métabolisme collagène de type I   Au cours de la résorption de la matrice osseuse par les ostéoclastes, ces molécules de pontage sont libérées dans la circulation et ne sont pas réutilisables lors de la formation osseuse. Elles ne subissent pas de métabolisme significatif et sont éliminées dans les urines sous forme libre (environ 40%) et sous forme peptidique (en viron 60%) de différentes longueurs. Ce rapport libre/lié n'est pas stable et évolue avec l'âge (diminution de formes liées avec l'âge) avec la nature des affections métaboliques de l'os et également lors des traitements anti résorbants. Le dosage des formes totales après hydrolyse acide ou des formes libres sans hydrolyse peut être réalisé par chromatographie HPLC (méthode de référence). Cette technique sépare les deux composés (PYR et DPYR) mais reste mal adaptée à la routine. Les pyridinolines peuvent être également mesurées par méthodes immunologiques utilisant des anticorps: soit dirigés contre les formes libres PYR et DPYR (Pyrilinks), DPYR (Pyrilinks D), (les dosages de DPYR sont adaptables sur des auto.mates d' ' immunoanalyse). soit dirigés contre les formes peptidiques N télopeptide croisé (NTX) utilisant un anticorps monoclonal spécifique d'une structure conformationnelle de la télopeptide N terminal de la chaîne  2. C télopeptide-CTx (Crosslaps). Dosages urinaires permettant la reconnaissance d'un octapeptide spécifique d'une séquence C terminale de la chaîne l du collagène de type 1(9). C télopeptide-croisé (ICTP) Utilise des anticorps polyclonaux dirigés contre le fragment C terminal du collagène de type I porté par les pyridinolines. Ce marqueur n'a pas une sensibilité ni une spécificité suffisante pour être utilisé dans l'ostéoporose. Grâce aux progrès technologiques, et en particulier à l'utilisation d'anticorps monoclonaux (à partir d'antigène d'origine humaine) qui ont permis l'amélioration de leurs sensibilité et spécificité, l'intérêt clinique des marqueurs osseux de résorption a été renforcé dans l'ostéoporose. Des études récentes ont montré que les différents traitements utilisés pour atténuer le remodelage osseux entraînent des effets variables sur les marqueurs issus des produits de dégradation du collagène. Ainsi, le Crosslaps sera diminué chez les femmes ménopausées ostéoporotiques traitées par oestrogènes ou biphosphonates, alors que la DPYR sera diminuée uniquement chez les femmes traitées par des oestrogènes (5, 7,10). FACTEURS À PRENDRE EN COMPTE DANS L'INTERPRÉTATION DES MARQUEURS OSSEUX En dehors d'importantes variations intra individuelles limitant l'utilisation de ces marqueurs à l'échelon individuel, de nombreux autres facteurs sont à prendre en compte lors de l'interprétation: L'âge Chez l'enfant, les concentrations varient en fonction de la vitesse de croissance. Chez l'adulte, le taux sera un reflet du niveau du remodelage osseux avec augmentation après 40 ans. Cette variabilité est aussi liée à une modification avec l'âge de l'excrétion urinaire des différentes formes des molécules de pontage du collagène. L'interprétation doit être faite en fonction de l'âge et du stade pubertaire (8, 10). Le sexe Chez la femme jeune, le taux de marqueurs est un re flet des modifications hormonales au cours du cycle menstruel. A la ménopause, ce taux sera influencé par le défi cit estrogénique. Les normes doivent donc être établies en fonction du sexe. Rythme circadien Les marqueurs osseux sont soumis à un rythme circadien avec un pic en fin de nuit et un minimum en fin de journée, en particulier pour les marqueurs de résorption (variations pouvant atteindre 50% pour la DPYR) (10). Les normes doivent prendre en compte également les modifications saisonnières liées à l'homéostasie calcique. Mode de vie L'absorption d'alcool, le tabagisme et la caféine s'accompagnent d'une diminution des taux, tandis que l'exercice physique s'accompagne d'une élévation de ces derniers. Pathologie associée Les taux des marqueurs sont le reflet des mécanismes physiopathologiques : ils sont élevés dans les pathologies à haut remodelage osseux et diminués dans le cas inverse. Si une autre pathologie est associée à l'ostéoporose, il faut en tenir compte pour l'interprétation des résultats: - au cours de l'insuffisance rénale, l'accumulation des molécules normalement éliminées par le rein sera un obstacle à l'utilisation diagnostique du marqueur (2). Traitements associés Au cours des traitements par de fortes doses de corticoides, la phosphatase alcaline n'est pas diminuée alors que l'ostéocalcine est effondrée, reflétant la déplétion ostéoblastique. De même, les traitements utilisés pour atténuer le remodelage osseux sont responsables d'effets différents sur les métabolites du collagène comme nous l'avons déjà vu (4). CONCLUSION Les marqueurs biochimiques ont déjà fait la preuve de leur efficacité dans l'exploration du remodelage osseux en complément des mesures de la masse osseuse. Leur utilisation en routine à l'échelon individuel reste encore un sujet de controverse. Une bonne connaissance des propriétés analytiques des techniques et des caractéristiques physiologiques de la molécule à doser permettrait leur meilleure utilisation, couplée à l'indispensable dialogue clinicien-biologiste. BIBLIOGRAPHIE I. BROWN JP., DELMAS PD., MALAVAL L Alkaline phosphatase and urinary hydroxyproline excretion. J. Clin. Invez. 1985: 76 : 2254 2258. 2. CALVOM MS., REYRE DR., GUNDBERG MC. Molecular basis and clinical application of biological markers of bone turn-over. Endoc. Rev. 1996; 17:333-363. 3. CORMIER C., SOUBERBIELLE JC., KINDERMANS C., MENKES CJ., SACHS C. Les marqueurs osseux. Immun. Biol. Spec. 1993 ; 8: 348-354. 4. CHRISTIANSEN C. RIIS BJ., RODBRO P. Screening procedure for women at risk of developing postmenopausal osteoporosis. Osteoporosis. Int. 1990; 1 : 35-40. 5. DELMAS PD. Biochemical markers of bone turn-over. J. Bone Miner. Res. 1993 ; 8 : 549-555. 6. GARNERO P., GRIMAUX M., SEGUIN P., DELMAS PD. 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